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      固定化微生物技術在受污養殖廢水水體處理和水華水域生物修復中的應用

      關鍵詞:

      固定化微生物技木作為一種新型的生物修復技術,具有高效、穩定、生物安全性較高等特點,已經廣泛用于各種污染水體的凈化修復之中,也包括受污染日益嚴峻的近海養殖水體。

      綜述從固定化微生物技術的出現和應用出發,對不同固定方法的優劣及其所擅長降解的污染物類型進行對比二對不同載體的特點進行分析,總結了固定化微生物技術在近海養殖水體污染修復的研究概況,并對當前該技術應用存在的問題進行分析和未來研究的方向進行展望。

      20世紀90年代以來,我國近海的水產養殖業發展迅速,集約化高密度的養殖模式雖然帶來了較高的養殖產出,卻給養殖水體帶來了大量的殘留詞料和排泄物,導致水體富營養化,甚至引起近海水華的暴發,對近海水域的生態平衡造成了嚴重的破壞。應用于近海污染水體的常規修復方法往往會引入新的物質,而以微生物修復為主的生物修復方式具有良好的生態安全性,越來越受到學者們的關注。

      固定化微生物技術作為生物修復的重要技術之一,采用吸附、包埋等方法將特定功能的微生物富集于特定的載體材料上,利用微生物對污染水體中過量的營養物質的吸收降解,實現對水體的凈化,防控近海藻華的暴發。該技術最早被應用于大腸桿菌的固定化,后被廣泛應用于工業發酵和廢水處理中,已形成一系列較為完備的理論和方法。與利用非固定化狀態的微生物進行生態修復相比,固定化載體既為菌體提供了必要的附著和保護的空間,又隔離了菌體與污染生境的直接接觸,避免引入微生物進行修復可能造成的新的生態危害。由此可見,對具有高效降解污染物質能力的微生物進行固定化并制成一定產品,投加到出現污染的近海養殖水體中,既能實現對污染水體的有效修復,又可保證避免了新的生態危害,具有重要的應用價值。

      1 固定化方法

      用于生物修復的微生物固定方法主要包括包埋法、吸附法等物理方法和共價結合法、交聯法等化學方法。

      1.1 包埋法

      包埋法是最為常用的固定化方法,是利用高聚物形成凝膠時將微生物細胞包埋在其內部,使微生物細胞在多孔載體內部得到擴散并無法漏出,而其他小分子底物和代謝產物能自由進出這些多孔或凝膠膜。常見的方法有:海藻酸鈣包埋法、聚乙烯醇包埋法和聚丙烯酰胺包埋法等。包埋法的主要優點是技術簡單容易操作,固定過程對微生物細胞的活性影響較小,高分子載體密度較低,易于流動,制備成形的固定化小球機械強度較高。但包埋材料對進出的底物和溶氧的擴散具有阻礙作用,不適用于對大分子污染物的處理。因此,在實際應用中,包埋法的應用較廣,作用時間較廣,常用于小分子污染物的降解。

      包埋法是進行菌株固定化常用的方法,在優化培養抑藻菌DH46的基礎上,利用海藻酸鈉-微孔淀粉復合包埋法對其進行固定化(圖1),并將制備的固定化微球應用于抑藻實驗中,實現對塔瑪亞歷山大藻生長的抑 制。該方法在學術界的應用較為廣泛:將聚乙烯醇應用到廢水降解菌株的包埋固定化中,考察所得的固定化產物在廢水處理過程中的物理穩定性,以及活性炭添加對其溶解度的影響。利用聚乙烯醇-硼酸包埋固定化EM菌的方法,在好氧、批式運行的條件下,以貝殼粉末作為添加劑,使包埋后的固定化產物對水體中的氨氮去除率達到了90% 以上;利用海藻酸鈉、聚乙烯醇對異養硝化好氧反硝化菌菌株進行包埋,制成了 SA、PVA、PVA-SA、PVA-SA-活性炭和PVA-SA-納米材料小球幾種不同類型的包埋固定化載體進行脫氮效果的研究,發現聚乙烯醇和海藻酸鈉比值為10:1時具有最佳的脫氮效果。


      1.2 吸附法

      吸附法也是常用的固定化方法,是利用微生物所具有的可吸附到固體物質表面或其他細胞表面的能力,將微生物吸附在附加劑表面的方法。一般又分為物理吸附和離子吸附兩種類型:物理吸附是利用硅膠、活性炭等具有高吸附能力的材料將微生物吸附其表面實現固定化;離子吸附是利用微生物在解離狀態下因靜電力的作用而固定于帶有相反電荷的離子交換劑上。吸附法對微生物無毒性,易與外界物質接觸,傳質效果好,但由于載體與微生物的結合力較弱,可固定生物量小,所以反應體系的穩定性較差,不利于長期反應,在實際應用中主要用于對大分子污染物的應急修復。

      吸附法的優點使其具有較高的應用價值,將聚氨醋泡沫剪成立方體,滅菌后與殺藻菌SP48進行共培養,菌體被成功吸附到泡沫表面,將固定化小塊取出放置在超凈臺內風干,加入到培養至指數生長期的塔瑪亞歷山大藻培養液中,以添加相應尺寸的空白小塊作對照,培養24h后計算殺藻率,最高殺藻率達96.2%以上(圖2)。該方法為近海養殖污染水體有害藻華的生物防治提供了重要的技術指導,該方法也已獲得國家發明專利。利用殼聚糖吸附劑固定化菌株在氣升式生物反應器中對廢水中存在的潤滑劑成分進行處理,使得洗車廢水中含25-200 mg/L,總石油碳氫化合物200h后的降解率穩定在85%左右,化學需氧量降73%左右。利用硅藻土作為固定化載體對具有降解鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)能力的微生物進行固定化,在不同的DBP初濃度、振蕩速度、pH值、溫度及重金屬化合物存在的條件下對DBP進行降解實驗和動力學分析,當DBP初濃度為100-500 mg/L范圍內,吸附固定化微生物對DBP的降解均保持較高的活性,24h降解率可達80%以上;葉海等[16]利用聚氨酯泡沫作為吸附載體,對產紫青霉菌株進行固定,優化得出泡沫顆

      1.3 交聯法

      交聯法屬于化學方法,采用具有2個或2個以上官能基團的試劑(如戊二醛、乙醇二異氰酸酯等) 與微生物細胞表面的反應基團發生反應,使微生物細胞之間相互連接形成網狀結構,從而實現細胞的固定。這種方法由于網狀結構的形成獲得了良好的穩定性,在長期的反應體系中菌體不易脫落。但反應過程中共價鍵的形成對微生物細胞的活性影響較大,與酶蛋白的交聯作用可能引起酶的失活。以碳酸鈣為成孔劑和環氧氯丙院為化學交聯劑制備大孔聚乙烯醇載體(CPVAF)對硝化細菌進行包埋,獲得了均一的孔徑和較高的理化穩定性, 并使其表面積和擴散系數增大,可以固定更多的菌體,達到更好的固定化效果。

      1.4 共價結合法

      共價結合法也屬于化學方法,其原理是利用固相載體材料表面的反應基團與微生物細胞表面的功能團之間形成化學共價鍵,實現對細胞的固定。 該方法與交聯法相似,具有較高的穩定性,其缺點也是對細胞活性的負面影響。利用自主專利的功能載體表面具有的-〇H、_NH2、-COOH、 -CH2以及-choch2等功能基團實現對微生物細胞的固定,在厭氧-好氧微生物系統中實現對六硝基芪的處理。

      1.5 其他固定方法

      除以上幾種較常見的方法,還有如包絡法、自身固定法等方法,以及將多種方法結合起來形成的復合方法。

      包絡法是以人工合成生物相容性較好的聚丙烯酸酯共聚物作為載體,使載體表面成膜,內部可以較好地聚集微生物細胞,克服包埋法的低傳質效率和吸附法的低穩定性。

      自身固定法是一種全新的固定化概念,也被稱之為無載體固定法,是利用微生物具有的自絮能力,使其形成顆粒使微生物產生自固定,這種方法保證了微生物形成適宜的生態環境,有利于微生物代謝之間的協調。以利用玉米為原料的無載體固定化酵母細胞酒精連續發酵工藝流程為例,介紹了這一技術在工業化上成功應用的實例,并對比通常的載體固定化細胞技術分析其優缺點,從而系統提出了無載體固定化細胞技術的概念。

      復合固定法是將兩種或多種固定化微生物方法結合起來,在應用上獲得單一方法所無法達到的性能或處理效果,從而提高了反應體系的效率,克服單一方法的不足,主要包括吸附-包埋法、包埋-交聯法、聚集-交聯法以及三法合用的吸附-包埋-交聯法等。以活性炭作為吸附劑,以聚乙烯醇作為包埋劑的復合法是最常見的吸附-包埋法;以海藻酸鈉 為載體,戊二醛為交聯劑是較常見的包埋-交聯法。 彭云華M探討了采用固定化微生物技術凈化高濃度有機廢水的多種方法,實驗結果表明利用海藻酸鈣包埋法與戊二醛交聯劑聯用的復合固定法,具有較強的機械強度,較長的使用周期,使得被固定細胞的脫氫酶活力相對穩定,有利于廢水生物處理領域的推廣應用。

      利用活性炭、粘土和藻酸鹽單獨或組合固定化苯酚降解微生物,發現粘土和活性炭的組合固定化可提高對高濃度苯酚的降解效率。利用玉米秸稈“吸附-包埋-交聯”復合固定化方法固定多環芳烴降解菌GY2B和GP3B,兩種菌的混合固定化小球對苗的吸收率在5d內達到98.2%;采用循環冷凍-解凍結合硼酸法,在聚乙烯醇固定化載體中加人海藻酸鈉、聚羥基丁酸酯和粉末活性炭制成復合載體包埋間甲酚優勢降解菌并對載體的結構、穩定性和擴散性進行研究;利用浸漬方法將聚乙烯醇(PVA)涂敷于多孔碳化硅板表面制備負載 誘導膜的多孔材料,借助載體結合法將活性污泥固定在其上,通過檢測固定微生物降解有機污染物后化學需氧量(COD)的變化來表征不同條件下PVA誘導膜上微生物的固定量,從結果可以看出PVA對微生物的固定有一定的誘導作用,PVA的pH值和濃度不同,微生物的固定情況也不同,微生物在PVA誘導膜固定的適宜條件為pH 7.0,濃度為5%。

      2 載體的選擇化

      固定化微生物技術中所選用的載體對于固定化效果有重要的影響,載體的類型和結構等各方面因素根據不同的固定化需求和微生物種類而有所差異,不同載體的優劣各有不同。理想的載體應該不溶于水、抗生物降解、機械強度好、擴散性好、固定化過程操作簡單、微生物細胞的截留量大、載體對細胞無毒性作用、傳質效果好及價格低廉等。

      固定化微生物中使用到的載體主要分為無機 載體、有機載體和復合載體三大類。

      無機載體常見的有活性炭、石英砂、陶粒、硅藻土等,這些材料表面積大,利于傳質,使固定微生物細胞可以獲得較好的營養,但材料的無機特點不利于細胞的固定,固定效果也較差。利用碳納米管、多孔陶粒、活性炭和石墨4種材料作為吸附固定化載體吸附包埋脫氮菌株,研究對人工廢水的脫氮效果,其中碳納米材料的效果最佳,脫氮率高達94%。

      有機載體又可分為天然有機載體和人工合成有機載體:天然有機載體如海藻酸鈣、瓊脂和殼聚糖等,毒性小,傳質效果好,但機械強度相對較低,不利于成品的長時間保存;人工合成的有機載體包括合成高分子載體聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等,人工合成載體固定效果好,機械強度大,但傳質效果較差,不利于保持細胞活性。利用一種多孔薄片狀材料對微藻進行固定化,應用在雙系統層中對廢水進行處理,氮磷降解率達到70%-90%。 利用海藻酸鈉和聚乙烯醇作為載體對銅綠微囊藻進行固定化,應用到對畜禽養殖廢水的處 理中,在降解游離態氨(NH4+-N)、總磷(TP)以及重鉻酸鹽指數(CODCr)上時獲得了顯著的效果。

      復合載體是將有機載體和無機載體相結合的方法,主要運用于復合固定法中。將活性炭、海藻酸鈣的復合材料對菌體進行包埋,提高了菌體降解苯釀廢水的能力;采用聚乙烯醇和海藻酸鈉作為復合載體,對污水處理廠曝氣池活性污泥進行固定化,制備出具有良好機械穩定性和生物活性的活性污泥顆粒,使其使用壽命提高到30d以上。

      在實際應用中,載體的選擇需要對所需固定的菌株和菌株的應用進行充分的考量,力求選取的載體對相關菌株的固定能夠較長時間地保證其細胞活性,獲得更為持久的效果。

      3 固定化微生物技術在受污染養殖水體和水華水域生物修復中的應用

      固定化微生物技術由于其高效、穩定和生物濃度大的特點,成為了現代環境污染生物修復的重要技術手段,在受污染水體的凈化以及水華水域對藻類的控制方面,成為重要的研究熱點。

      受污染的養殖水體最明顯的特點是其氮磷含量過高,因此該領域的關注點主要集中在利用固定化微生物技術去除過量的氮磷。采用2%的海藻酸鈉與8%的聚乙烯醇按2:100的體積比混合作為固定劑,將小球藻與有效微生物菌群(EM菌)、小球藻與活性污泥、小球藻與EM菌及活性污泥在同等條件下進行固定化處理,制作成藻菌膠球,并分析了3種藻菌膠球對珍珠蚌養殖廢水中TN 和TP的去除效果以及光照度和溫度對三者脫氮除磷的影響,以及3種藻菌膠球對氮磷的去除效果以及相應過程中光照強度、溫度的影響,并擬建了溫度(T)、pH、光照強度(I)、溶解氧(DO)和填充率這五因素與氨氮去除率(AR)之間關系的模型,獲得了最佳去氨氮組合為:溫度30°C、pH 7.0、光照強度6 000 lx、溶解氧5.0 mg/L和填充率10%。利用陶粒對巨大芽孢桿菌和彎曲芽孢桿菌及進行固定化,并以室內水族缸模型進行水的凈化處理實驗,研究了固定化載體、空載體以及大型水生植物粉綠狐尾藻在單獨或聯合的條件下對氮素的處理效果,發現固定化載體和粉綠狐尾藻聯合使用對水體的氮素和COD的去除率較高,水體凈化效果較為顯著,該研究也為生態的水體凈化模型提供了新的方案和技術指導。

      由于不同類型固定化材料的選擇對養殖水體的凈化效果差異明顯,因此材料的選擇也是研究的熱點。利用普通活性炭、生物活性炭、 沸石和硅藻土等載體對微生物制劑菌液進行固定化處理,將固定化后的載體應用到已設計好的養殖池塘的不同圍隔之中,每隔7d采樣檢測水中葉綠素a含量、水溫、溶氧(DO)、pH、氨氮(NH4+-N)、 硝氮(N03-N)和化學耗氧量(CODCr)等指標,結果證實固定化方法顯著提高了微生物對污染底質的生物修復能力,特別是生物活性炭和沸石固定這兩組效果顯著。利用改良沸石結合微生物制劑和生物活性炭結合微生物制劑對凡納濱對蝦生產性養殖池塘水質進行調控修復,發現其能顯著改善池塘水質、穩定水體藻相結構和提髙微生物對污染底質的生物修復能力。采用由生化球(材質為聚丙嫌)、陶粒和泡沫塊三部分組成的新型復合載體固定亞硝酸鹽氧化菌,研究掛膜條件和不同水力停留時間對去除率的影響,得出了在水力停留時間為1h時獲得最高的NCV-N去除率為76.94%,相關研究為該生化球在蝦養殖廢水的處理中獲得應用提供了重要實驗基礎。但在實際應用研究上,一些常見的固定化材料并不適用,采用2%海藻酸鈉溶液固定微生物對淡水養殖廢水中活性磷、氨態氮、硝態氮、亞硝氮和化學需氧量質量濃度的影響進行考察,評估海藻酸鈉固定化微生物處理淡水養殖廢水的可行性,發現海藻酸鈉在養殖廢水中的凈化作用不顯著。在這種情況下,固定化材料可能成為過剩的營養源,導致水體的富營養化,因此需要選擇高效的材料并注重材料的及時回收,以防止二次污染。

      近海養殖水體的污染往往造成水華的暴發,關于水華水域水體的生物修復也成為學界的研究熱點,利用微生物進行藻華控制的研究具有重要的應用潛力。 利用微生物對近海赤潮污染的防治和調控的研究,分離出大量在游離狀態下可以有效抑制有害赤潮藻類生長的殺藻菌。但由于自然水體環境的復雜性使得這些成果很難應用在實際生境中,很多實驗室環境下具有較強殺藻效果的菌株難以應用到現場水域,因此采取固定化微生物技術,將能夠抑制藻類生長的殺藻菌固定在一定的材質上,既可以增加單位水體中的菌體濃度,又可以給殺藻細菌形成一個保護環境有利其生長,并方便于制備穩定性良好的殺藻制劑,易于規模化擴大。利用聚氨酯泡沫吸附法固定化培養菌株,提高了載體內的菌體密度,并在實驗室條件下模擬單細胞赤潮藻塔瑪亞歷山大藻的生長(圖3),并按PUF:藻液=2g:lL的比例進行抑藻實驗,4d后抑藻率高達88.7%,連續觀察10d發現抑藻率穩定在96%,水體顯著澄清,該法將為近海赤潮污染水體的治理提供重要的理論和實踐指導。該領域的研究在國內外都處于起步階段,實現固定化微生物在水華水體中對藻體生長的抑制還需要進行更為深人的應用研究。


      4 存在的問題與應對策略

      隨著研究的深人,將固定化微生物技術運用于近海養殖水體和水華水域的生物修復中,已形成了一定的體系,但在實際應用中仍面臨著一系列問題。因此,提出可行的策略解決相關問題,將使固定化微生物技術具有更為廣闊的應用前景。

      4.1 特定生物修復功能微生物資源的開發

      固定化微生物技術雖然利用到一系列外部材料,但其核心是具有特定生物修復功能的微生物,具有生物修復功能的微生物應能有效利用污染水體中的污染物進行增長,實現污染物的吸附降解,使水體環境得以修復。用于固定化技術的菌株還需要有較強的穩定性,抵抗外部環境變化的能力較強。

      因此,當前有限的菌種資源便成為重要的制約因素,需要投入更多的資源對特定功能的微生物進行發掘。首先,形成明確的篩選目的,以特定污染物的降解或特定藻類的抑制作為出發點,進行微生物的定向篩選,獲得更多具有生物修復功能的微生物,及時開展修復功能的研究工作。其次,在菌株的保存上,應對相關特定生物修復功能微生物進行分類,建立專業的菌種庫,結合信息技術建立完善的特定菌種數據庫,實現菌種的信息化管理。最后, 在菌種庫的管理上,應加強與不同地域其他菌種資源的聯系,互相交換和補充,發掘現存菌株在不同地域可能存在的新的生物修復潛力。

      4.2 固定化微生物菌體的高產優化

      利用固定化微生物技術控制近海養殖水體的污染具有經濟、高效和環境友好的特點,但在獲得高產微生物以適應現場實驗對大量菌體的要求上仍存在一定的挑戰,對固定化微生物菌體的優化是一種急需解決的問題。與此同時,從實驗室的研究到現場的應用,需要考慮成本的問題,利用高產優化工作降低菌體生產的成本,可以為固定化產品的制備提供最基礎的應用可能。在實現殺藻微生物的發掘工作之后,往往會對具有特定功能的殺藻微生物進行發酵優化,利用均勻設計和神經網絡發酵的方法,將菌株的抑藻效率提高了 16.90%,獲得最優的培養基配方和發酵條件參數。

      菌體的高產優化使抑藻菌體的生產從搖瓶培養逐步擴大到中試發酵罐水平,利用更為廉價高效且更具實用意義的培養基配方進行發酵工藝的改良,形成較為完善的殺藻菌體發酵生產體系,將獲得的菌體結合固定化微生物技術制備成菌劑進行保存,以作為現場實驗的菌劑儲備。

      由此可見,大量菌體的獲得是固定化微生物技術的前提,在保證菌體生長穩定性的前提下,優化更為快速高效的發酵培養基組分及發酵條件,對固定化微生物技術從實驗室條件到現場的廣泛應用具有重大的影響,需要引起更多的關注。

      4.3 低價高效固定化載體的開發

      固定化技術需要用到優質的載體,但載體的效果和經濟成本往往存在著一些矛盾。例如,陶粒和沸石等價格相對低廉的載體固定效果較差,且在自然水體的投加體積相對較大,可能影響到水體自身;海藻酸鈉和殼聚糖等一系列固定效果較好的載體,由于其加工成本較高,不利于實際應用。載體的壽命也是實際應用中載體效果的重要因素,直接關系到固定化載體在污染水體中的使用時間,對于水體污染的修復具有實際意義。因此,需要進行不同學科之間的結合,考慮特定的固定化需求,與材料、化學、物理等學科的研究者進行合作,實現特定載體的研發和供應;從實際應用的角度,將特定載體從研究投入到工廠環節,降低載體的成本,為固定化微生物技術在實際污染水環境中的應用提供基礎。

      4.4 新型固定化反應器的開發

      固定化微生物技術的發展以污染水體的生物修復為目的,但將固定化后的載體應用到現場,無論是在相對固定的養殖廢水排放通道,還是相對開放的水華暴發水域,都需要有特定的反應器承載固定化產物進行生物修復。在這一點上,傳統的污染水體修復所應用到的反應器不再適用于新的固定化技術。由此可見,需要著手開發新型的固定化反應器,特別是受污染的養殖水體的實際情況,在一般反應器的基礎上因地制宜地進行設計,才能使固定化微生物技術更好、更快地實現在現場的應用。

      5 研究展望

      由于養殖業的發展,近海養殖水體的污染程度越來越高,富營養化的水體容易引起藻華暴發,使水體的生物修復成為當前急需解決的環境問題。固定化微生物技術已經成為生物修復領域關注的重點,在污染水體和水華水域的修復已被廣泛研究, 但當前的研究主要還處于實驗室水平,將固定化成果應用于污染水體現場需要解決一系列實際問題。 由于固定化微生物技術的高效、穩定和環保等特點,使其應用正在不斷的深入研究之中,相信能在近海養殖水體和水華水域污染的生物修復上發揮巨大的作用。

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